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氢气抑制肺癌的细胞学和动物模型实验研究

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来源:富氢水杯 2019-06-15

阅读要点

●从细胞增殖、细胞成瘤、细胞活性、细胞周期和凋亡、细胞转移侵袭等方面,研究了氢分子对人类肺腺癌细胞A549的作用。

●裸鼠腋下成瘤实验中,发现吸氢氧混合气体组的裸鼠瘤块要明显小于正常组瘤块大小;细胞形态学上,加入氢气后,癌细胞的数量降低和外观发生空泡化。

●细胞学研究结果表明,氯分子降低了A549细胞的增殖速率,同时抑制了细胞迁移的能力,本实验提示氢气吸入对非小细胞肺癌者有铺助治疗作用,为氯分对肺癌的防治提供了一定的实验基础。

氢气抑制肺癌的细胞学和动物模型实验研究

实验一、氢气实验性肿瘤形成的影响

方法:将 BALB/C裸鼠6只,平均分成A和B两组,分别为正常组和吸氢组(吸入氢氧混合气体)。

注射肿瘤细胞成瘤:将A549细胞扩增至一定数量后,将细胞用胰蛋白酶消化、收集;在SPF环境下观察裸鼠3天,状况良好,准备接种细胞;超净台内,75%酒精消毒裸鼠注射部位皮肤,在裸鼠后肢注射含5×10°细胞的细胞悬液;刺入点距注射点约1cm,形成一隆起皮丘,防止液体漏出后消毒皮肤,观察成瘤情况。

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干预方法:A组裸鼠成瘤后不做任何处理,正常环境下饲养;B组裸鼠成瘤后每天给予氢氧混合气体(667%H2+33%02)吸人,每天6小时,流量3升/分钟,共14天。

实验结果:正常组裸鼠瘤块增长速度在3周前呈现缓慢递增趋势,3周后则为快速增长;与正常组相比,吸氢组的瘤块增长速度则显得持续缓慢(见图1)。

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最终形成的瘤块大小,吸氢组裸鼠要明显小于正常组(见图2)。

同时,在实验过程中,发现正常组的裸鼠饮食量明显少于吸氢组。大体解剖上,正常组裸鼠的肺、肝脏和肠都明显肿大,而吸氢组裸鼠的脏器都相对正常(见图3)。

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还发现,正常组瘤块生长区域有较多的微血管增生,而吸氢组则无此现象,微血管较少(见图4)。

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实验二、细胞形态学观察

方法:将A549细胞扩增至一定数量后,用胰蛋白酶消化,收集;重新铺板于两个35皿中,分为两组:正常细胞培养箱培养和氢氧混合气体培养箱培养(66.7%H2+33.3%O2);每隔两天换液一次,长满后进行传代;传代的A549细胞继续按照亲代的培养环境进行培养;持续观察两组细胞至第10代。

结果:第一代时,两组气体环境下培养的细胞无明显差异,增殖情况类似,细胞状态较好(见图5a);第5代时,氢氧混合气体组的A549细胞的增殖受到抑制,细胞体积增大,细胞死亡较多(见图5b);第10代时,氢氧混合气体组的细胞出现了更多的空泡化(见图5c)。

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实验三、细胞免疫荧光观察

方法:收集对数生长期的A549细胞,计,数,用全血清培养基稀释细胞悬液至5×100000/mL,接种于6孔板的细胞玻片上。置于CO2细胞培养箱中培养24小时,根据实验分组每孔更换普通培养基或者含氢培养基,继续培养24小时。加入稀释的 anti-Vimentin抗体(空白对照加入PBS,实验组加入抗体),再加入稀释的荧光二抗,加 Hoechst进行核染色。取出细胞玻片,荧光显微镜下观察、拍照。

结果:本实验提示氢分子对A549细胞生长的作用。与普通培养基培养的对照组相比,氢分子处理后,癌细胞株生长变缓慢。由第1代到第10代中的红色荧光(BrdU染色)明显减少表明氢气抑制细胞的生长(见图6)。

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实验四、A549细胞周期检测

方法:收集对数生长期的细胞,计数,用全血清培养基稀释细胞悬液至2×100000/mL,接种于6孔板中。置于CO2的细胞培养箱中培养24小时,根据分组每孔换成普通培养基或者含氢养基,继续培养24小时。取出固定后的细胞,离心,去掉固定液,加入200微升细胞周期检测试剂,流式检测。

结果:如图7所示,与普通培养基培养相比,氢气处理的A549细胞的S期细胞数量显著减少,G2/M期细胞显著增加,提示氢可能通过减少S期分裂以及G2/M期阻滞,影响细胞周期,抑制癌细胞增殖,促进细胞的凋亡。

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图7:A549细胞在两种不同气体环境下的生长差异。氢气处理组S期细胞数量显著减少,G2/M

期细胞显著增加

实验五、验胞迁移观察

方法:采用细胞划痕试验。取对数期生长的细胞,消化后计数,在含5%C02饱和湿度的培养箱中培养,待细胞长满板底后,用200微升的黄枪头垂直于孔板沿直线制造细胞划痕,尽量使每个划痕的宽度一致。分组加入1%FBS的普通培养基和含氢培养基,将培养板放入培养箱中继续培养,在划痕后的0、24小时拍照记录。缩时录像0至24小时的细胞迁移的情况,观察氢对肿瘤细胞迁移能力的影响。

结果:经过24小时的培养,细胞开始向中间移动,加入氢培养基后,A549癌细胞的迁移能力显著降低。

结论

本实验从细胞增殖、细胞成瘤、细胞活性、细胞周期和凋亡、细胞转移侵袭等方面,测试了上海潓美公司生产的氢氧气雾化机制备的氢氧混合气体对人类肺腺癌细胞A549的作用效果,结果显示氢气能显著改变肿瘤细胞形态,改变细胞周期,促进凋亡,抑制肿瘤细胞生长、运动、侵袭和迁移。

国内王东昌等采用上海潓美制造的氢氧气雾化机做了类似试验,探讨了氢气对非小细胞肺癌的生长和侵袭性的抑制作用。由于他们采用了与本实验同样的氢氧气雾化机,蒙作者同意,摘要转载如下(原文发表于《国际呼吸杂志》,2018年,38:561-565):

方法:荷瘤裸鼠模型建立。将培养的人肺癌细胞株A549细胞悬浮液,接种于BALB/c雄性棵鼠前肢背部皮下。待移植瘤达到平均直径约4毫米时,将裸鼠分为对照组、氢气组。对照组鼠吸入空气;氢气组吸入66%常氢气+34%氧气(漓美,型号ANS-H-01)。均每天吸入2小时。4周后处死裸鼠,取下瘤体,记录瘤体的体积及重量,取组织进行组织学、免疫组织化学和各种分子检测。

结果

(1)移植肿瘤的生长和重量:瘤细胞接种后第1周,对照组和氢气组瘤体的大小差异无统计学意义;随着氢气干预时间的延长,肿瘤体积逐渐出现差异,至2周时,两组间的差异有统计学意义;干预4周后,氢气组的肿瘤明显小于对照组(见图8),肿瘤生长的差异也随时间延长而变大(见图9)。

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(2)肿瘤的组织学和免疫组织化学改变:对照组痛体组织HE染色显示细胞排列紧密,且细胞的密度相对较大,形态的异质性显著,即呈典型的癌症表现;氢气组细胞的密度相对较小,其异质性较对照组出现降低,即显示肿瘤的“癌性”低于对照组(见图10)。

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(3)对瘤组织中Ki-67、C0X-2、VEGF蛋白含量进行检测,对照组有较多含量的核深染,氢气组中这3种蛋白深染的相对较少(见图11)。

结论:氢气可抑制非小细胞肺癌生长,降低癌症侵袭性,这种抑制作用与下调Ki-6、C0X-2、VEGF表达有关

王颖 赖姵榛

标签:氢呼吸   医学  专家学者

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